新規遺伝子サイレンシング技術

CRES-T法（Chimeric REpressor Silencing Technology）

産総研では植物特異的な転写抑制ペプチド（Repression domain: EAR-motif）を発見しました。このRepression domainを機能未知の転写因子に付加し、リプレッサーに機能変換し、キメラリプレッサーとして植物体に導入します。キメラリプレッサーは内在性の転写因子だけでなく機能重複する転写因子の転写活性能に優先して標的遺伝子の発現を抑制することから、その転写因子の欠損株(Loss-of-function allele)と同様な表現型が現れます。その結果、その転写因子の機能を知ることができます。このジーンサイレンシングの手法をCRES-T法（Chimeric Repressor Silencing Technology）と命名しています。CRES-T法は高効率で作用し、RNAi法やTag-lineを用いた解析法よりもより簡便且つ効率の高い手法です。

CRES-T法による転写因子の機能解析

　CRES-T法が、重複遺伝子が多く存在する植物の転写因子遺伝子の機能解析に有効な方法であることを示すため、欠損株ないし変異株の形質がわかっている転写因子のいくつかを例にとってCRES-T法を適用した例を示します。MYB転写因子ファミリーの中でもトライコーム形成に関与することが推定されているMYB23にCRES-T法を適用すると、形質転換体において葉のトライコームが完全に欠失あるいはトライコームの数が大幅に減少した形質が確認されました(図1)。

　また、同じMYBファミリーの転写因子であるPAP1は赤い色素であるアントシアニンの合成系の制御に関与している転写因子ですが、PAP1にCRES-T法を適用すると通常ならアントシアニンを蓄積するような環境下でも、形質転換体ではアントシアニンの蓄積が見られませんでした。この植物体では、フラボノイド合成系に関与する形質以外に、トライコームの異常やその他の形態変化が認められないことからCRES-T法は、転写因子の標的遺伝子のみを制御し、本来の下流遺伝子ではない遺伝子群に影響を与えていないと考えます(図2)。

図２．PAP1キメラリプレッサー発現体（右）、野生型（左）タンニンの生合成も抑制されることから、キメラリプレッサー発現体種子は、タンニンが蓄積されないため明るい黄色となる（インセット写真）

　次は、機能が重複している転写因子群にCRES-T法が有効に機能していることを示す例です。NAC転写因子ファミリーに属するCUC1, CUC2は重複した機能を持っていますが、両方の遺伝子が欠損する場合にのみカップ状の子葉を形成することが知られています（CUC形質）。CRES-T法ではいずれかの一方をリプレッサーに変換した転写因子を導入することにより、形質転換体においてカップ状あるいは、弱いcuc変異型の表現型（ハート型子葉）が観察されました(図3)。

CRES-T法による雄性不稔植物の作出

シロイヌナズナの花器形成に関与するABC遺伝子がコードする転写因子であるAPETALA3 (AP3), AGAMOUS(AG), LEAFY (LFY) および葯の裂開を制御するMYB26をCRES-T法を用いてキメラリプレッサーに変換しました。それを植物に導入して結果、何れのキメラリプレッサーも高頻度で不稔を優性形質として誘導することが示されました。AP3キメラリプレッサー発現体の場合は、全ての発現体の９８％以上花器で雄しべの形成が阻害された雄性不稔体でありました。また、AGキメラリプレッサー発現体ではおしべとめしべが消失し、がくと花びらが幾重にも繰り返す八重咲き状の花を形成しました。
CRES-T法を用いることによって、高い頻度で不稔化を誘導することが出来ることから、花粉の飛散を含め遺伝子組替え植物の拡散の防止、交配が容易になるなど、植物の育成に有効な方法であると考えられます。（図４）

機能性付加植物作成にむけて

シロイヌナズナの転写因子を網羅するキメラリプレッサー植物体ライブラリーを構築し、このライブラリーからストレス応答に対して、非感受性植物の単離を行っています。その結果、誘導されたストレス応答に関与する転写因子の同定が可能となります（図B）。本手法により種々のストレス応答制御における転写因子を同定することによりレギュロンバイオロジーを利用した植物バイオテクノロジーの拡大に大いに貢献できると考えられる。